近日，由福建医科大学从属第一病院杨康博士与贝瑞基因（000710）配合筹商效果“ dmTGS: Precise Targeted Enrichment Long-Read Sequencing Panel for Tandem Repeat Detection”在检测医学限制的外洋泰斗学术期刊Clinical Chemistry在线发表。这是贝瑞基因在三代测序平台斥地的复杂基因变异疾病会诊本领的又一伏击进展。
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筹商配景
串联重叠（Tandem repeats, TRs）是在通盘这个词东谈主类基因组中常见的遗传突变，其长度从2个碱基对（bp）到特等100 bp不等。当今已知有特等70种疾病与TRs动态突变关连。TRs的分子特征包括重叠数动态变化、高GC含量以及复杂的序列构成，这关于依赖PCR的传统RP-PCR和AL-PCR有极大的挑战。此外，重叠区两侧轻微变异可能会导致假阴/假阳的产生。Southern blot本领由于分辨率低、窒碍具体序列信息、过程零星、DNA样本量需求大以及通量低等成分，限度了其在临床中的豪爽愚弄。比年来，高通量测序（NGS）在遗传病会诊限制获得了权贵进展，但由于其对GC含量的偏好性和短读长的限度，抵制了其在临床会诊中的豪爽愚弄。长读长测序（LRS）的出现为TRs的筹商提供了新的机遇，尤其是在处理GC含量丰富和复杂序列方面。本筹商旨在斥地一个基于长读长测序以评估与疾病关连的已知TRs的panel，并探讨其临床愚弄价值。
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筹商步地
本筹商纳入了108个疑似动态突变疾病的样本，包括来自Coriell Institute的19个基因组DNA样本（www.coriell.org/）和福建医科大学从属第一病院的89个临床样本。
斥地了针对已知TRs位点检测的本领：三代测序动态突变检测（dynamic mutation third-generation sequencing, dmTGS）。
对108个样本进行dmTGS 检测，将完毕与传统的分子步地比较。
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筹商完毕
斥地了一种针对动态突变疾病辨认会诊的本领-dmTGS
为了竣事对动态突变疾病的全面、精确和高效的基因筛查和会诊，课题组基于三代单分子长读长的高准确性上风，斥地了dmTGS新本领（图1）。该本领偶然高通量检测已知动态突变疾病中串联重叠的扩增情况。既能精确检测重叠数，又能准确辅导具体序列信息。
图1. dmTGS检测过程浮现图
dmTGS可精确检测串联重叠数
图2. dmTGS与其他分子检测本领比较
（表格部分展示）
dmTGS可准确地检测极度扩增等位基因（图2，绿框），比较于传统的分子本领如RP-PCR、AL-PCR和Sanger测序（图2，红框），提供了更精确的重叠单位计数。这种精确度关于会诊一些疾病的浅近和致病界限的重叠数相等接近时至关伏击，如AR（浅近界限9-36，致病界限38-68）、HTT（浅近界限6-35，致病界限36-250）和ATXN1（浅近界限6-38，致病界限39-88）等。dmTGS可准确检测重叠单位数量，其明天在临床中的豪爽愚弄或将再行界说某些疾病的现存致病阈值，匡助临床笃定某些动态突变疾病的空缺阈值。
dmTGS偶然精确检测中断序列
筹商标明，FMR1 基因中CGG重叠单位内AGG的插入会加多遗传沉稳性，ATXN1、ATXN2、DMPK 和HTT 的中断序列有同样的作用。然则，当今的临床分子本领仅检测序列的扩增界限，无法精确重叠序列具体信息，因此很多基因中插入其他序列的作用尚未都备相识。明天，dmTGS检测不错识别更多基因中的中断基序，并说明它们对疾病发生、进展、预后和生殖的生物学影响。此外，dmTGS还不错检测到FMR1 中低水平的体细胞嵌合CGG扩增（图3），其关于前突变和都备突变的分析贤慧度区分为1%和5%，与RP-PCR格外。
图3. dmTGS可检测FRM1体细胞嵌合CGG延迟
dmTGS 可检测VNTR
可变数量串联重叠序列（variable number tandem repeat, VNTR）表现出高度的多态性。当今已报谈与疾病关连的基因有 PLIN4、EIF4A3、PRNP、CACNA1C、ABCA7 和WDR7，这类串联重叠的检测关于传统步地是一个极大的挑战，如PLIN4 为99bp重叠序列极度扩增，先前的筹商仅通过PCR扩增跑胶大要笃定扩增次数。而dmTGS偶然提供看重的碱基序列信息（图4），这为筹商PLIN4 肌病或其他VNTR重叠单位多态性的分子机制偏激对临床的影响提供最中枢的数据开始。
图4. dmTGS可准确检测
VNTR重叠单位序列（以PLINK4为例）
评估dmTGS的临床效用：
为了进一步评估dmTGS的临床效用，本筹商对57名临床高度疑似动态突变关连肌肉疾病的患者进行了检测，其中52例检测到极度扩增：1例GIPC1 基因GGC极度重叠扩增导致的眼咽远端肌病2型、1 例NOTCH2NLC 基因GGC极度重叠扩增导致的眼咽远端肌病3型、2例NUTM2B-AS1/LOC642361 基因GGC极度重叠扩增导致的眼咽肌病伴脑白质病1型、48例DMPK 基因CTG极度重叠扩增导致的强直性肌养分不良1型（DM1）；5例疑似DM1患者完毕为阴性，这与成例分子步地的完毕一致，预计可能是由于其他未知基因导致。
在DMPK的阳性病例中，14.5%的DM1患者佩戴CCG中断，这显著高于先前报谈的3%-5%。此外，检出了1例患者在传统分子步地漏检的情况，具体如下：
临床体征：神经系统检查败出头部肌肉萎缩，斧头脸、鹅颈外不雅，口齿不清，颈部屈肌肌力2级，上肢远端肌力4级。叩击性肌强直阳性。肌酸激酶水公谈常。肌电图败露肌源性窜改，大都强直电位。临床高度怀疑肌强直性养分不良症。
基因检测：RP-PCR及NGS检测DMPK 基因CTG重叠次数为13/13次（图5）。
dmTGS完毕：DMPK 基因CTG极度扩增为13/586次。
图5.DM1患者基因检测完毕
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量度
传统分子步地在靠近GC富集区域、极长重叠或由各样基序构成的重叠序列时会碰到极大的挑战。本名目组斥地了一种全面、精确、快速检测动态突变疾病的分子本领dmTGS欧洲杯投注入口，在与其它临床分子检测的并行比较中，该步地展示出了更优的效用和临床适用性。
